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Monodisperter Dota-PEG-konjugiertes Anti-Tag-72-Diabor hat eine niedrige Nierenaufnahme und ein hohes Tumor-Blut-Verhältnis, was zu einem verbesserten 64-c-Haustier führt

Anzahl Durchsuchen:0     Autor:Lin Li, Fabio Turatti, Desiree Crow, James R. Bading, Anne-Line Anderson, Erasmus Poku, Paul J. Yazaki, Lawrence E. Williams, Debra Tamvakis, Paul Sanders, David Leong, Andrew Raubitschek, Peter J. Hu     veröffentlichen Zeit: 2022-04-28      Herkunft:Journal of Nuclear Medicine July 2010, 51 (7) 1139-1146

Monodisperter Dota-PEG-konjugiertes Anti-Tag-72-Diabor hat eine niedrige Nierenaufnahme und ein hohes Tumor-Blut-Verhältnis, was zu einem verbesserten 64-c-Haustier führt

Diabörper sind nichtkovalente Dimere von einkettigen Antikörperfragmenten, die die Avidität von intaktem IgG beibehalten, aber eine günstigere Blutdlearung haben als intakte IgG. Radiometale bieten eine breite Palette von Halbwertszeiten und Emissionen für die Anforderungen an die Bildgebung und Therapie und bieten eine einfache Kennzeichnung von Chelat-Antikörper-Konjugaten. Aufgrund ihrer hohen Retention und ihres Stoffwechsels in der Niere kann die Verwendung von radiometal markierten Diablen sowohl für die Bildgebung als auch für die Therapie problematisch sein. Methoden: zuvor gezeigt, dass 111in-dota-Polyethylenglykol (PEG) 3400-anti-carcinoembryonaler Antigen-Diabor weniger als die Hälfte der Nierenaufnahme und der Retention von nicht-pegyliertem Diabor aufweist und dass die beiden ähnlich hohe Tumoraufnahme und Retention haben, wir syntheteten, wir syntheteten Ein ähnliches Derivat für ein Anti-Tumor-assoziiertes Glykoprotein 72-Diabor. Wir reduzierten auch die molekulare Größe des polydispersen PEG3400 auf monodisperste PEG27 und PEG12 (nominelle Massen von 1.321 bzw. 617). Wir führten Bioverteilungen ihrer Dota-Konjugate durch, die mit 125i, 111in oder 64 cu in tumorhaltigen athymischen Mäusen umgezogen wurden. Ergebnisse: Die Zugabe von PEG3400 zu dem Diabor reduzierte die Nierenaufnahme auf einen Niveau (~ 10 prozentuale injizierte Dosis/g) vergleichbar mit dem mit radiometal markierten intakten IgG. Die PEG27- und PEG12-DIDODER-Konjugate zeigten auch eine geringe Nierenaufnahme ohne Verringerung der Tumoraufnahme oder des Tumor-Blut-Verhältnisses. Bei radioaktiv markiert mit 64cu gaben die Dota-PEG12- und -PEG27-Diabodin-Konjugate bei athymischen Mäusen hochkontrastische Haustierbilder von Dickdarmkrebs-Xenotransplantaten. Schlussfolgerung: PEGylierte Diabörper können eine wertvolle Plattform für die Abgabe von Radionukliden und anderen Wirkstoffen an Tumoren sein.

Um effektive Tumorbildgebungsmittel zu sein, müssen gezielte radioaktiv markierte Antikörper sowohl eine hohe Tumoraufnahme als auch hohe Tumor-Blut-Verhältnisse liefern1,2). In einem extremen monoklonalen Antikörpern (150 kDa) haben eine relativ langsame Blutdlearung (β-Half-Leben -blood -Verhältnisse. Im anderen extrem werden rekombinante Fragmente (25 kDa) einketten FV (SCFV) schnell aus dem Blut (T1/2β, 0,5–2,0 h) geräumt, was zu hohen Tumor-Blut-Verhältnis im Tumor (3). Nach Analyse einer Reihe radioiodierter rekombinanter Antikörperfragmente (4), wir und andere kamen zu dem Schluss, dass die gleichzeitige Leistung einer hohen Tumoraufnahme und des hohen Tumor-Blut-Verhältnisses einen zweiwertigen Antikörper der Größe 50–80 kD erfordert (1,3,4) mit Diabroden (nichtkovalente Dimere der Größe 55 kDa) als eine Plattform, die diese Kriterien erfüllt. Zum Beispiel haben 124i-markierte Diabodien in einem präklinischen PET-Modell gut abgebildet (5). Ein Nachteil von radioiodierten Antikörpern ist jedoch, dass sie in Geweben, einschließlich Tumor, schnell metabolisiert werden können, insbesondere wenn das Antigen bei Antikörperbindung einer Internalisierung erfährt. Radiometal markierte rekombinante Antikörperfragmente bieten eine signifikante Verbesserung des Tumor-Blut-Verhältnisses, dies wird jedoch durch hohe Nierenretention ausgeglichen. Somit ist die systemische Ausscheidung von radiometalen Metaboliten im Vergleich zu radioiodischen Stoffwechselprodukten langsam. Wir haben 111in-dotaε-Lysin als das metabolische Endpunktprodukt in der Niere für 111in-Dota-Anti-Karcinoembryonal-Antikörper-Fragmente (CEA) (CEA) identifiziert6).

Wir und andere haben versucht, den Nutzen zu verbessern oF radiometal markierte rekombinante Antikörperfragmente durch Verringern der Nierenaufnahme oder -retention. In einem Ansatz wird die Nierenaufnahme teilweise durch die Verabreichung von intravenösem L- oder D-Lysin (7,8). Alternativ haben wir einzigartige metabolisierbare Linker zwischen dem Antikörper und Dota entworfen, die im Vergleich zu N-Hydroxy-Succinimid (NHS) -Dota-Konjugaten (NHS) -DOTA-Konjugate (n-hydroxy succinimid) (Nierenretention () konzipiert haben.9). Ein dritter Ansatz besteht10). Dieser Ansatz wurde erfolgreich auf Anti-CEA-F (AB ') Fragment A5B7 angewendet, indem es an MPEG6000 konjugierte, was die Tumorretention und die Serum Halbwertszeit um 6- bzw. 5-fach erhöhte ((bzw. 5-fach11). Im Fall von Antimucin SCFV CC49/218 konjugiert an PEG5000 wurde ein 14-facher Anstieg der Serum Halbwertszeit beobachtet (12). In dieser Studie kamen die Autoren zu dem Schluss, dass mit zunehmender Größe von PEG -Polymeren anstelle der Gesamtmenge an PEG mehr Verbesserungen beobachtet wurden, was häufig zu einer verminderten Immunreaktivität des Konjugats führte. In einer anderen Studie entwickelten die Forscher ein Anti-Mucin-1-dimerischer SCFV-Thiol (55 kDa) mit C-terminalen Cysteinresten für die ortsspezifische Konjugation an Maleimid-PEGs unterschiedlicher Größe (13). Sie kamen zu dem Schluss, dass die Konjugation vor der klinischen Anwendung verbessert werden muss. Interessanterweise ein neuer Bericht (kürzlich (14) bewertete eine 40-kDa-verzweigte Kette, die an einen bispezifischen Diabor konjugiert war, der kovalent an CEA und CD3 gebunden war, und zeigten, dass die Peglation die Tumoraufnahme und eine erhöhte Zirkulationszeit verdoppelte (T1/2β, 50 h). In der gleichen Untersuchungslinie haben Leong et al. (15) verwendete die natürliche Thiolgruppe eines konstruierten Fab'-Fragments zu IL-8 für die Konjugation an Maleimid-PEGs unterschiedlicher Größen. Sie fanden heraus, dass die Konjugation an Maleimid PEG 10 kDa zu einer scheinbaren molekularen Größe von 180 kDa führte, die mit der Größe eines intakten Antikörpers vergleichbar war. Wichtig ist, dass Blutdefinitionsstudien ein T1/2β von 44 h im Vergleich zu 3 h für die nicht modifizierte Fab 'zeigten. Auch Yang et al. (10) Konjugierte Maleimid-Stecker unterschiedlicher Größen zu einem Anti-Tumor-Nekrosefaktor-α-SCFV (halb so groß wie ein Diabor) mit einem Cystein, der in die Linkerregion oder C-Terminus konstruiert ist. Sie fanden heraus, dass die Konjugation an Maleimid PEG (20 kDa) eine Blutungs halbwertsfreie ergab, die dem von intaktem IgG ähnelte, jedoch keine Schlussfolgerung hinsichtlich der Wirkung der PEG-Modifikation auf die Nierenretention lieferte.

Vor kurzem haben wir gezeigt, dass PEG3400 zu dem Hinzufügen111In-dota-Anti-CEA-Diabor reduzierte die Nierenaufnahme von 24 bis 48 Stunden von über 200 Prozent injizierten Dosis ( %ID)/g für den nicht-pegylierten Diabor auf 50 %ID/g, während die hohe Tumoraufnahme (Aufnahme hoher Tumoraufnahme (16). Eine weitere Verringerung der Nierenaufnahme ist jedoch erforderlich. Um die DIDODE-Abhängigkeit der Dota-PEG3400-Konjugation zu untersuchen, haben wir einen Anti-Tumor-assoziierten Glykoprotein 72 (Tag-72) -Diabody erzeugt und pegylierten mit intaktem IgG. Dies deutete darauf hin, dass die Nierenaufnahme eine Funktion sowohl der scheinbaren molekularen Größe (wie durch PEG) als auch einer anderen weniger definierten Faktoren ist, die für den Diabor intrinsischen (z. B. Modifikation des isoelektrischen Punktes [PI], die die Nierenaufnahme beeinflussen (die Nierenaufnahme (17,18)).

Nachdem wir die Nierenaufnahme durch Konjugation an PEG3400 reduziert hatten, versuchten wir, den Ansatz weiter zu untersuchen, indem wir monodisperste Dota-PEG-Konjugate verwenden. Wir synthetisierten Dota-Peg27-Cys-VS- und Dota-Peg12-Cys-Vs, wobei Cys-VS Vinylsulfon ist, die an das Thiol von Cystein konjugiert sind, und diese monodispersen Stifte auf den Diabor bei pH 9,0 konjugiert, eine Reaktion, eine Reaktion, wir Wir haben uns an Aminogruppen auf dem Diabor bei pH 9,0 konjugiert, eine Reaktion, eine Reaktion, wir Wir haben uns an Aminogruppen auf dem Diabor bei pH 9,0 konjugiert, eine Reaktion, eine Reaktion, wir wir haben wir an Aminogruppen auf dem Diabor bei pH 9,0 konjugiert, eine Reaktion, wir wir uns zuvor beschrieben haben (19). Die Konjugate wurden durch Massenspektrometrie, isoelektrische Fokussierung (IEF) und Größenexklusionschromatographie charakterisiert. Bioverteilungen von111Inmarkierte Konjugate in athymischen Mäusen mit LS-174T-Dickdarmtumor-Xenotransplantaten, die Tumoraufnahmen von 40–45 %ID/g, Tumor-Blut-Verhältnis von 8–10 und eine Nierenaufnahme von 10 %ID/g bei 24 h . Darüber hinaus Haustier mit64Cu-markierte Konjugate lieferten innerhalb von 24 h nach der Injektion mit hohen kontrastischen Tumorbildern (Tumor-Blut-Verhältnis, 8: 1).


Materialien, Radiolabellen, Massenspektrometrie

LS-174T-Zellen wurden von ATCC erhalten und wie zuvor beschrieben gehalten (16). 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7-TRIS (t-Butylacetat) -10-Essigsäure wurde von Macrocyclics, Inc. NHS-PEG3400-VS (Katalog Nr. 4M5B0F02) erhalten, wurde von Nektar bezogen.N-Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC) -amido-dpeg27-Säure wurde von Novabiochem (EMD Biosciences) und erhaltenN-Fmoc-amido-dpeg12-Säure wurde von Quanta Biodesign Ltd.111In-Chlorid war aus Amersham,64Cu von der Washington University School of Medicine, und125Ich von Perkin Elmer. Massenspektren wurden auf einer agilenten 6520 Quadrupol-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Gerät aufgezeichnet.

Konstruktion, Klonierung, Expression und Reinigung von Anti-Tag-72-Diabor

Der Anti-TAG72-Diabor (AVP04-07) basierte auf V-Domänen aus dem übergeordneten CC49-Antikörper- und Derivat-SCFV-Fragmenten. Das Gen hatte Codons optimiert fürEscherichia coliAusdruck mit der Orientierung vH-VL(wo vHund vLsind die variablen Domänen der schweren bzw. leichten Ketten), verbunden mit einem G.4S Linker und beinhaltete einen C-terminalen6Schwanz. AVP04-07 wurde in UnterklonE coliBL21 (DE3) (f ompt hsdsB(rBmB)Gal DCM(DE3)) (Novagen) und in einem 18 -l -Fermenter produziert. Bakterielles Lysat durch Zentrifugation (16.000 ×g, 30 min) und die Filtration bei 0,45 μm wurden unter Verwendung eines 3-Stufen-Verfahrens (HISTRAP, HITRAP SP HP und Superdex 75 Prep-Chromatographie; GE Healthcare) auf einem Akta-Reiniger 10 (GE Healthcare) gereinigt.

Analytische Ultrazentrifugation

Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimente wurden unter Verwendung eines Beckman-Modells XL-I-Analyse-Ultrazentrifuge bei 20 ° C durchgeführt. Daten wurden bei a gesammelt290 nmIm kontinuierlichen Modus unter Verwendung eines Zeitintervalls von 300 s und einer Schrittgröße von 0,003 cm ohne Durchschnittsgröße. Lösungsmitteldichte (1,00499 g/ml bei 20 ° C), Lösungsmittelviskosität (1,0214 CP) und ein teilweise spezifisches Volumen für AVP04-07 wurden unter Verwendung des Programms SEDNTERP berechnet. Die Sedimentationsgeschwindigkeitsdaten wurden unter Verwendung des Programms SEDfit (SEDFIT () in ein kontinuierliches Modellverteilungsmodell angepasst (www.analyticalultracentrifugation.com).

Immunreaktivität und IEF

Die Bindung von AVP04-07 an das Tag-72-Antigen wurde unter Verwendung von Rinder-Submaxillarmucin (Aldrich-Sigma) in einem Säulenverschiebungsassay (Superdex 200) bestimmt. Die IEF -Gel -Elektrophorese wurde entweder auf einem IEF -Vorstockgel (pH 3–10) (NOVEX) oder einem Pharmacia Phastgel gemäß den Anweisungen des Herstellers betrieben.

Konjugation von AVP04-07

NHS-dota wurde wie zuvor beschrieben an AVP04-07-Diabor konjugiert (16). NHS-PEG3400-VS wurde wie zuvor beschrieben an AVP04-07-Diabor in einem Molverhältnis von 30: 1 und pH 6,0 konjugiert (zuvor beschrieben (19). Das Konjugat wurde mit Cysteinmido-dota (20) bei einem Molverhältnis von 50: 1.N-Die FMOC-Amido-Peg27 . DOTA-PEG27-CYS-VS wurde mit AVP04-07-Diabor in einem Molverhältnis von 50: 1 reagiert. Die Synthese und Konjugation von DOTA-PEG12-Cys-VS-VS-VS-DIDODER in Molverhältnissen von 20: 1 und 50: 1 wurden wie oben beschrieben durchgeführt.

Radiolabelung von AVP04-07 und seinen Konjugaten

AVP04-07 und seine Konjugate wurden radioiodiert mit125Ich (Perkin Elmer) unter Verwendung der Iodo-Gen-Methode (21). N / A125I (5–10 μl, 26 mbq) wurde zu 200 μg AVP04-07 in einem mit 20 μg Iod-Gen (Pierce) vorbeschichteten Röhrchen gegeben und 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die radioaktiven Ausbeuten betrugen 80%–100%. Die Radiometalmarkierung von DOTAA-AVP04-07 wurde durchgeführt111Inkl3(0,15 mbq/μg) oder64Cucl2(0,37 mbq/μg), wie zuvor beschrieben (beschrieben (19). Radiolabeling -Ausbeuten betrugen typischerweise 70%–90%. Das radioaktiv markierte Material wurde auf Superdex -75- oder -200 -Säulen gereinigt.

LS-174T Xenotransplantatmodell

Weiblich, athymischnu/nuMäusen (Charles River Laboratories), 6–8 Wochen alt, wurden LS-174T-Zellen (10) injiziert (106) Subkutan in der Flanke. Nach 10 Tagen wurden Mäusen intravenös zu einer Mischung (200 & mgr; l) von 370 kbq von injiziert125I-labeled und 150 kbq von111Inmarkiertes AVP04-07 (2–6 μg Gesamtprotein) für Bioverteilungsstudien. Die Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten eingeschläfert: Tumor, Blut und Hauptorgane wurden gesammelt, gewogen und mit Korrektur für die Übergänge von gezählt111In Zählungen in die125Ich kanale. Zeit -Aktivitäts -Kurven wurden für radioaktives Zerfall korrigiert und als %id/g dargestellt.

HAUSTIER

Tumor-tragende Mäuse wurden intravenös injiziert64Cu-markierte Diabor- oder Diabor-Peg-Konjugate und abgebildet bei 1, 4, 21–22 und 45–46 h mit einem kleinen PET-Scanner (Micropet-Modell R4; Siemens/CTIMI). Mit Isofluran anästhesierte Mäuse wurden 20 Minuten lang an den Zeitpunkten von 1 und 4-Stunden, 45 Minuten bei 21–22 h und 60 Minuten bei 45–46 h gescannt. Die Daten wurden unter Verwendung der Fourier-Rebinning-Methode in zweidimensionale Sinogramme sortiert und für intraszanische Radiode, Detektor-Uneinheitlichkeit und zufälliges Zufallsrauschen korrigiert. Die Bilder wurden von der iterativ geordneten Subsets-Erwartungsmaximierungsmethode (4 Iterationen, 16 Teilmengen) rekonstruiert.

Vergleich der Bildgebungsmerkmale zwischen Diabor und Derivaten

Eine bildgebende Figur von Verdienst (IFOM) wurde sowohl auf planare als auch auf PET -Bilder angewendet (1,2,16). Das IFOM zur ZeittNach der Injektion ist definiert als:Mathematikmit cv0Der Variationskoeffizient des Unterschieds in Tumor- und Hintergrundzählungen ist (Zählungen des Tumors (z), ε der Detektoreffizienzfaktor, λ die Zerfallskonstante,A0, die Gesamt -injizierte Aktivität und das Volumen des Tumorvolumens. Aufnahme (%id/g) wurde als bezeichnet alsuT(Tumor) unduB(Hintergrund). Bei der Darstellung dieser Funktion setzen wir das Produkt von Lebenslauf0, ε,A0und vol gleich der Einheit. Die einzigen Variationsquellen sind Tumoraufnahme, Hintergrundgewebeaufnahme und physischer Zerfall. Beachten Sie, dass IFOM (t) <0 impliziert, dass Hintergrundgewebe (Blut oder Niere) zum Zeitpunkt eine größere Aufnahme als Tumor hatt.

Charakterisierung von AVP04-07 Diabod

AVP04-07 DIDODER INE coliund gereinigt durch eine 3-Stufenhttp://jnm.snmjournals.org) als monodisperter Dimer mit einer scheinbaren molekularen Masse von 52,5 kDa durch analytische Ultrazentrifugation (ergänzende Abb. 1B). Es hatte eine Immunreaktivität von mehr als 99%, wie sie anhand eines Säulenverschiebungsassays beurteilt wurde (ergänzende Abb. 1C).

Bioverteilung von111In-dota- und125I-AVP04-07 in Athymic Maus LS-174T Xenotransplantatmodell

125I-dota AVP04-07 und111In-dota-AVP04-07 hatte ähnliche Blutspur, wobei etwa 50% des Radiolabel 1 h nach der Injektion und 10% im Kreislauf 4 h entfernt wurden.Feigen. 1a und 1b). Die Nierenaufnahme war hoch (100 %ID/g bei 24 h) für111In markiert, aber nicht125I-labeld Diabor, der zeigt, dass die Niere der Hauptweg der Freigabe war. Für die111In markiertes Diabor gab es eine signifikante Tumoraufnahme, wobei über 25 %ID/G bereits 4 Stunden nach der Injektion beobachtet wurde und mehr als 20 %ID/g bei 48 Stunden zurückgehalten wurden. Das Tumor-zu-Blut-Verhältnis für111In-AVP04-07 betrug mehr als 50: 1 bei 24 h.125I-labeld AVP04-07 ergab Tumoraufnahme von 17 bzw. 10 %ID/g bei 4 bzw. 48 Stunden.

Synthese und Bioverteilung von Dota-Cys-VS-PEG3400-AVP04-07

Da die Pegylierung die Nierenaufnahme von radiometal markierten Diablen reduziert, konjugierten wir zuerst AVP04-07 an Dota-Cys-VS-PEG3400-NHS, wie zuvor für einen Anti-CEA-Diabor (DIDOBAD (CEA) (DIDA ((16). VS-PEG3400-NHS wurde an Oberflächenlysine des Diabors (über aktives Ester) konjugiert, gefolgt von einer Reaktion mit Dota-Cys (20). Die Analyse durch Natriumdodecylsulfat und IEF -Gelelektrophorese weisen auf eine erwartete Verschiebung zu niedrigerem PI (IEF -Gel, ergänzende Abb. 2A, Spur 5) sowie eine Verschiebung auf eine höhere scheinbare Molekulargröße aufgrund der Zugabe von PEG3400 (Natriumdodecylsulfat -Gel, ergänzend Abb. 2b, Spur 5). Das Konjugat wurde mit radioaktiv markiert111Inkl3, chromatographiert auf Superdex 75 und verglichen mit unkonjugiertem AVP04-07 (ergänzende Abb. 2a und 2b). Das scheinbare Molekulargewicht des PEG3400 -Derivats betrug 105 kDa gegenüber 52,5 kDa. Der Anstieg kann auf den Effekt der Pegylierung auf den Stokes-Radius zurückgeführt werden und ähnelt der Verschiebung der Größe, die wir für PEG3400-Derivatisierte Anti-CEA-Diabor beobachtet haben (DIDODE (16).

Die Bioverteilung von111IN-AVP04-07-PEG3400 wird in gezeigtAbbildung 1c. Die Nierenaufnahme betrug 98 %ID/g bei 24 Stunden für nicht-pegylierte Diabor (Abb. 1a) und 8,4 %ID/g bei 24 Stunden für PEGylated Diabods (DIDODER (Abb. 1c). Die große Verringerung der Nierenaufnahme durch Pegylierung ging mit einer Erhöhung der Tumoraufnahme von 22 auf 46 %ID/g bei 24 h und einer Verringerung des Tumor-Blut-Verhältnisses (> 46: 1 bis 2: 1 bei 24 Stunden) einher. . Die Zunahme der Tumorretention ist offensichtlich auf die längere Blutdlealisierung von pegyliertem Diabor (T \"zurückzuführen1/2β, 36 h) versus nicht-pegyliertes Diabor (T. T.1/2β18 h). Die Verringerung der Nierenaufnahme war viel größer als zuvor beobachtet mit111In-dota-cys-VS-PEG3400 Anti-CEA-Diabor (16). Mögliche Erklärungen für die beobachteten Unterschiede werden später diskutiert.

Synthese und Bioverteilung von monodisperter PEG27 AVP04-07

Obwohl die Konjugation von AVP04-07 an eine PEG3400-Einheit eine verringerte Nierenaufnahme erreichte, hätte PEG3400 aufgrund seiner inhärenten Polydispersität und der daraus resultierenden Unfähigkeit, Produkte herzustellen, die chemisch zu charakterisieren sind, als klinisches Produkt als klinisches Produkt. Mehrere monodisperste Stiftbausteine ​​sind im Handel erhältlich, die unter Verwendung der Peptid -Synthese -Methodik in heterobifunktionelle Reagenzien umgewandelt werden können. Somit haben wir zuerst ein Dota-PEG27-Cys-VS-Derivat synthetisiert, wie in ergänzenden Schema 1 zusammengefasst. Zweitens konjugierten wir Dota-PEG27-Cys-VS zu Oberflächenlysine des Diabors bei pH 9,0 bei einem Molverhältnis von 50: 1 (22). Wenn das Konjugat durch IEF und Natriumdodecylsulfat -Gelelektrophorese (ergänzende Abb. 2) charakterisiert wurde, wurden die erwarteten Verschiebungen in PI und molekularer Größe beobachtet. Das111In (Abb. 2, grüne Spur) und125I Radioaktiv markierte Produkte wurden auf Superdex 75, dem gesammelten Hauptpeak, gereinigt und biologische Verteilungsstudien durchgeführt. Die Inspektion des Chromatogramms und des Vergleichs mit nicht pegyliertem Diabor zeigen eine Verschiebung der scheinbaren molekularen Größe.

Bioverteilungsergebnisse sind in gezeigtAbbildungen 3a und 3b. Trotz des geringeren Molekulargewichts des PEG27 -Derivats als des PEG3400 -Derivats wurden fast äquivalente Ergebnisse erzielt (vergleichen mitAbb. 1c). Bei 24 h Nierenaufnahme von111In markiertes Konjugat betrug 8,3 %ID/G, Tumoraufnahme von 49 %ID/G und das Tumor-Blut-Verhältnis 4,2: 1. Angesichts der ermutigenden Verringerung der Nierenaufnahme für das PEG27 -Derivat haben wir beschlossen, das analoge PEG12 -Derivat zu synthetisieren und zu testen.

Synthese und Bioverteilung von monodisperter PEG12 AVP04-07

Wir synthetisierten Dota-PEG12-CYS-VS (Ergänzungsschema 1) und konjugierten es an AVP04-07 bei pH 9,0 unter Verwendung von Molverhältnissen von 20: 1 und 50: 1. Unmodifizierte AVP04-07 und die 2 Konjugate wurden durch hochauflösende Nanospray-Massenspektrometrie analysiert, um ihre Substitutionsgrade zu bestimmen (Feigen. 4a und 4c). Der unmodifizierte Diabor gab eine Reihe von M/Z -Arten, die bei entfalteten Beschäftigten eine berechnete Masse von 26.869 hatten (Abb. 4a), in guter Übereinstimmung mit der durch die Aminosäuresequenz vorhergesagte. Zur Konjugation an Dota-PEG12-Cys-Vs bei einem Molverhältnis von 20: 1 unterscheiden sich die entfalteten Peaks alle durch Vielfache von 1.225 Masseneinheiten (Abb. 4b), wie erwartet für die Konjugation mit Dota-PEG12-Cys-VS. Die Massenunterschiede sind für die Konjugation von 50: 1 -Molverhältnis gleich, werden jedoch auf einen höheren Substitutionsgrad verschoben (Abb. 4c). Mithilfe von Peakhöhen als Schätzung berechnen wir einen Durchschnitt von 1,7 PEGs pro Monomer für das 20: 1 -Konjugat und einen Durchschnitt von 3,0 PEGs für das 50: 1 -Konjugat. Wenn jedes Konjugat mit getestet wurde mit markiert mit111In (178 mbq/mg) ergab das 20: 1 -Konjugat 8,3% Einbau von Radiolabel und die 50: 1 ergab 92%.

Bioverteilungsdaten für111In und125I-markierte Dota-PEG12-Cys-VS-AVP04-07 waren denen für die PEG3400- und PEG27-Derivate ähnlich (Feigen. 3c und 3d). Bemerkenswerterweise war die Nierenaufnahme anfangs höher (13,4 %ID/g) für den PEG12 als das PEG27 Konjugate.

Bioverteilungsdaten für111In und125I-markierte Dota-PEG12-Cys-VS-AVP04-07 waren denen für die PEG3400- und PEG27-Derivate ähnlich (Feigen. 3c und 3d). Bemerkenswerterweise war die Nierenaufnahme anfangs höher (13,4 %ID/g) für den PEG12 als das PEG27 Konjugate.

64Cu PET von Dota-Peg-Konjugaten von AVP04-07

Haustier von64Cu-markiert AVP04-07 (Abb. 5a) zeigten eine relativ bescheidene Tumoraufnahme und eine hohe Nierenaufnahme über 2 Tage für den nicht-pegylierten Diabor. Im Gegensatz dazu zeigten die PEG12- und PEG27 -Konjugate bereits eine relativ geringe Nierenaufnahme und eine hohe Tumoraufnahme bereits 21–22 h (Feigen. 5b und 5c). Die gemessene Tumoraufnahme für PEG12 betrug 49 ± 3 %ID/g bei 46 h mit einem Tumor-Blut-Verhältnis von (9 ± 4): 1. Diese Ergebnisse ähneln denen für die111Inmarkiertes Konjugat und schlägt vor, dass die Wahl des Radiometals nur geringe Auswirkungen auf die Bioverteilung hat, eine Beobachtung, die wir zuvor für einen Anti-CEA-Diabor gemacht haben (Diabor (16).

Vergleichende Bildgebungseigenschaften von64Cu- und111Inmarkierte AVP04-07 und seine Dota-Peg-Konjugate

Zum Vergleich verschiedener pegylierter Versionen von AVP04-07 mit beiden mit beiden111In oder64Cu, wir untersuchten 2 Parameter: absolute Tumoraufnahme und Tumor zu Nontumorverhältnissen unter Verwendung eines IFOM (23). Die Bioverteilungsdaten wurden auch für Vergleiche auf demselben Diagramm wiedergegeben (ergänzende Abb. 3). Die pegylierten Versionen übertreffen den nicht-pegylierten Diabor sowohl in Bezug auf die absolute Tumoraufnahme als auch die Tumor-zu-Blut111In und64Cu. Die in ergänzenden Abbildung 4 dargestellten IFOM -Diagramme prognostizieren die beste Bildgebung mit beiden64Cu-markierte nicht-pegylierte Diabor nach 10 h oder der64Cu-markierte PEG12-Version bei 20 h. Mit111In der Bildgebung ist das PEG12 -Konjugat bei 30–40 h optimal. Wenn das Hintergrundgewebe jedoch Niere ist, zeigt nicht pegylierte Diabod das negative Kontrast bis 50 h, da die Nierenaufnahme und die Retention von Radiolabel retentieren. Alle pegylierten Diabodien hatten eine ähnliche Bildqualität bis 50 h, mit einer leichten Kante zum PEG27 -Konjugat, wenn sie bei 10–15 Stunden abgebildet sind64Cu und 20–30 h für111In.









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